对“裹尸布”的真实性的最致命一击发生于1988年。那一年，罗马教廷令人惊讶地同意让科学家用同位素法测定“裹尸布”的年代。这需要对“圣物”有意造成一点损害：剪下一小块“裹尸布”，测定其中碳14的含量。
有的化学元素有几种不同原子量的原子，称为同位素。碳元素有三种同位素，根据其原子量的大小，分别称为碳12、碳13和碳14。其中碳12的含量最多，约占地球上碳原子的99％，碳13约占1％，而碳14的含量只有百万分之一。但是碳14含量虽少，却很有用，因为它具有放射性，会缓慢地按固定的速率衰变成氮原子。碳14的半衰期为5730年，也就是说，每过5730年，碳14的含量就会减少一半。这个衰变速率是永恒不变的，不受外界任何因素的影响。
生物在活着的时候，它们会不断地从外界吸收碳原子，包括碳14，这样碳14在生物体内的含量就基本不变。但是生物死后，不能再吸收外界的碳14，而体内原有的碳14将会按固定的速率衰变。这样，通过测定生物化石或生物制品中碳14的含量，再根据其半衰期，就可以计算出该生物体是在什么时候死的，也就可以确定生物化石或生物制品产生的年代。用碳14可以测定年龄在大约6万年以内的样品，如果样品的年龄超过了6万年，就要用其他半衰期更长的放射性同位素来测了。
1988年4月21日，在都灵大主教和录像机的监视下，从“裹尸布”剪下了长3英寸、宽0.5英寸的一小块，剪的位置既远离布上的人像，也远离烧焦的部分和1534年修补的部分。这小块布被进一步剪成三块邮票大小的样品，分别交给了美国亚利桑那大学、英国牛津大学考古学研究所和瑞士苏黎世联邦理工学院的实验室，由他们用碳14法测定“裹尸布”的年龄。3个实验室都得到了相同的结果，“裹尸布”里的亚麻是在公元1260至1390年之间的某个时候收割的。这个时间段与“裹尸布”在里雷教堂首次面世的年代一致，与据称耶稣死亡的年代（约公元30年）则大相径庭。这就确凿地证明了“裹尸布”的确是14世纪的赝品。
这是三个世界著名的实验室分别独立地测出的一致结果，如果要指责他们都犯了操作错误未免太可笑了。但是坚信“裹尸布”的真实性的信徒们还是提出了种种理由来质疑这个结果。有的和神创论者一样，干脆从根本上质疑碳14测定法的可靠性，这就意味着不仅对“裹尸布”的测定结果有误，对所有其他历史文物、化石的测定结果也都有误，为了维护“裹尸布”的真实性而把其他文物、化石的真实性也都一笔抹煞，也是很可笑的。有的声称高温会改变碳的结构，而“裹尸布”曾经经历过高温，所以测定的结果比实际年龄小。这种说法同样是荒唐的，再高的温度也不可能改变元素的结构，高温对放射性同位素测定法的结果不会有影响。还有一种说法是误用了1534年修补“裹尸布”用的布料做为样品（虽然在取样时已确保不会搞错），那样的话，测出来的年代又太老了，老了200年。
最聪明的质疑理由是说样品受到了微生物污染。如果“裹尸布”上面生活着细菌或真菌，它们制造出来的单糖和多糖也含有碳，而且是年代比较近的碳，在测定“裹尸布”年代的时候，这些年代比较近的碳混杂在其中，就会使测定的结果比实际的要年轻。这种情形是可能发生的，但是要把一件1世纪的文物误测为14世纪，污染物的量必须非常大，需要占到总量的三分之一，那样的话，很容易用肉眼就能看出样品有一层厚厚的污染物了。而实际上，美国两家实验室分别用不同的方法对“裹尸布”样品做了检验，都未发现有受到微生物污染的迹象。
总之，不论是历史的记载、常理的推断还是科学的检验，都表明“裹尸布”是中世纪的赝品。但是对迷信的人们来说，再确凿的证据也无法动摇他们的信念。无数的信徒仍然坚信“裹尸布”就是耶稣的裹尸布，“裹尸布”上的人像就是耶稣留下的。2000年“裹尸布”最后一次展出时，仍然吸引来了上百万朝圣者。下一次的展出要等到2025年，朝圣的人数大概也不会少多少。今天的朝圣者的心态，与中世纪的时候并没有什么不同。而对教会来说，只要能吸引来朝圣者，管它是真是假呢。
